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核酸相关> 反转录与PCR> 等温扩增
Bst DNA Polymerase, Large Fragment
产品编号: D7050M
产品包装:4000U
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价格: ¥ 516.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7050S Bst DNA Polymerase, Large Fragment 800U 133.00元
D7050M Bst DNA Polymerase, Large Fragment 4000U 516.00元

碧云天生产的Bst DNA Polymerase, Large Fragment,即嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus, Bst) DNA Polymerase I大片段,具有5'→3' DNA聚合酶活性,不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bst DNA Polymerase, Large Fragment具有很强的链置换(strand displacement)能力,可应用于核酸的等温扩增反应,如环介导的等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)和滚环扩增(Rolling-circle amplification, RCA)等。

Bst DNA Polymerase, Large Fragment介导的等温扩增温度一般在50-68℃之间,通常为65℃。与Bst DNA Polymerase 2.0相比,本产品在进行等温扩增时不具有将dUTP掺入合成的DNA链的能力。

Bst DNA Polymerase具有5'→3'的核酸外切酶活性,而Bst DNA Polymerase, Large Fragment通过删除突变而缺失了5'→3'核酸外切酶活性。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10nmol of dNTP into acid insoluble material in 30 minutes at 65℃。

碧云天生产的Bst DNA Polymerase, Large Fragment酶活性参考图1。

图1. 碧云天Bst DNA Polymerase, Large Fragment进行环介导等温扩增反应的效果。使用本产品或N公司的Bst DNA Polymerase, Large Fragment,在25µl体系,分别以不同量的(10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 ng)烟草花叶病毒的CaMV35启动子为模板,8U的Bst DNA Polymerase, Large Fragment (图1中简写为Bst),引物:1.6µM FIP/BIP、0.2µM F3/B3、0.4µM LoopF/B,1.4mM dNTP each,在1X Bst Reaction Buffer中补加MgSO4至终浓度为8mM,65℃孵育1h,80℃加热20min灭活,然后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示,本产品与Competitor N公司的产品相比,具有略好或至少相当的酶活性效果。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。

来源:Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I的大片段通过大肠杆菌重组表达和纯化而获得。

纯度:无DNA内切酶和外切酶活性。

用途:环介导等温扩增LAMP、解旋酶等温基因扩增(HDA)等DNA等温扩增,多重置换扩增(MDA),全基因组扩增(WGA),高GC含量DNA的测序,纳克级DNA模板的快速测序,建库测序等。

酶储存溶液:10mM Tris-HCl (pH7.5), 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% Triton X-100, 50% (v/v) glycerol。

10X Bst Reaction Buffer:200mM Tris-HCl, 100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 20mM MgSO4, 1% Triton X-100, pH8.8 at 25°C。

失活或抑制:80℃加热20min。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7050S-1 Bst DNA Polymerase, Large Fragment (8U/μl) 100µl
D7050S-2 10X Bst Reaction Buffer 300µl
D7050S-3 100mM MgSO4 200µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7050M-1 Bst DNA Polymerase, Large Fragment (8U/μl) 500µl
D7050M-2 10X Bst Reaction Buffer 1.5ml
D7050M-3 100mM MgSO4 1ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

Bst DNA Polymerase, Large Fragment不具有3'→5'核酸外切酶活性。

建议等温扩增反应温度不能高于70℃,否则会导致酶失活。

Bst DNA Polymerase,Large Fragment不能用于热循环测序和PCR。

每次等温扩增实验注意设置无模板DNA作为阴性对照。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.引物设计:
环介导的等温扩增引物的设计可以参考http://primerexplorer.jp/e/,建议使用V5版本。具体操作手册可以在http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html下载。环介导等温扩增引物的初步筛选可参照该操作手册,具体需要通过实验来验证比较合适的引物。LAMP引物由4个或6个(含Loop)引物组成,建议加入Loop环引物设计,即设计6条引物进行实验。
2.以LAMP等温扩增为例,参考下表设置反应体系。
Reagent Volume Final concentration
Nuclease-Free Water (13.5-x)μl -
10X Bst Reaction Buffer 2.5μl 1X
MgSO4 (100mM) 1.5μl 6mM (8mM total)
dNTP (10mM each) 3.5μl 1.4mM each
FIP/BIP Primers (25X, 40μM) 1μl 1.6μM
F3/B3 Primers (25X, 5μM) 1μl 0.2μM
LoopF/B Primers (25X, 10μM) 1μl 0.4μM
Template xμl >10 copies or more
Bst DNA Polymerase, Large Fragment (8U/μl) 1μl 320U/ml
Total volume 25μl -
注1:在配制反应体系完成后,可每25μl体系的反应管管盖加适量高浓度的SYBR Green I 1μl,待等温扩增反应结束后,8000g离心1min,反应体系变荧光绿为阳性,保持无色或棕色为阴性。也可以无需添加指示剂,待反应程序结束后,可见反应液明显变浑浊为阳性,反应液保持透明为阴性。
注2:如需优化反应,可调整Mg2+浓度(4-10mM),酶量(0.04-0.32U/μl)或改变反应温度(50-68℃)。
注3:如果通过琼脂糖凝胶电泳或其它需要打开LAMP反应容器的方法进行分析,请设置辅助分析区域和设备,以避免污染。
注4:由于反应比较迅速,为了确保实验的重现性,建议模板DNA最后加入。
注5:强烈建议设置未加模板的阴性对照,以确保扩增的特异性。
注6:为了防止在配置试剂时发生污染,请务必在超净工作台内进行操作。
注7:试剂及模板DNA的配置操作尽量需要和PCR产物的电泳等分析在不同的区域进行,以免发生污染。
3.反应程序:65℃ 60min。
4.灭活:80℃ 20min。
5.如实验需要,可以用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析,电泳图显示扩增产物为梯度条带为阳性,无梯度条带为阴性。
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D7050S Bst DNA Polymerase, Large Fragment 800U
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D7053S phi29 DNA Polymerase 250U
D7053M phi29 DNA Polymerase 1kU
D7053L phi29 DNA Polymerase 5kU
D7053XL phi29 DNA Polymerase 20kU
D7055S Bsu DNA Polymerase, Large Fragment 200U
D7055M Bsu DNA Polymerase, Large Fragment 1000U
D7359-250µl dUTP (100mM) 250µl
D7359-1ml dUTP (100mM) 1ml
D7360S Uracil-DNA Glycosylase (E. coli) 1000U
D7360M Uracil-DNA Glycosylase (E. coli) 5000U
D7362S Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium) 100U
D7362M Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium) 500U
D7364S Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod) 200U
D7364M Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod) 1000U
D7364L Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod) 5000U
D7371 dNTP Mixture (2.5mM each) 1ml
D7373 dNTP Mixture (25mM each) 250μl
D7376-1ml dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM) 1ml
D7376-5ml dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM) 5ml
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