T4 DNA Ligase/T4 DNA连接酶

产品简介

产品简介：

产品编号	产品名称	产品包装	产品价格
D7006	T4 DNA Ligase	40,000U	48.00元

    T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。
    用途：T4 DNA Ligase常用于DNA片段和载体、linker或adaptor等的连接。也可以用于缺刻修复及Ligase介导的RNA检测。
    来源：本T4 DNA Ligase由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。
    活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃ in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM(300 μg/ml)。200U等于1个Weiss unit，以Weiss unit计，本产品共200单位。
    T4 DNA Ligase连接产物转化感受态后涂板LB平板的效果参考图1。

    图1. 本T4 DNA Ligase的连接产物转化感受态细菌后涂板获得的LB平板效果图。A. 双酶切后的载体自连过夜；B. 双酶切后的载体与待插入片段过夜连接。
    纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规连接反应要求。
    酶储存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50%
(v/v)glycerol。
    10X Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 5 mM ATP。
    失活或抑制：65℃孵育10分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈抑制T4 DNA Ligase。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D7006-1	T4 DNA Ligase(1000U/μl)	40,000U
D7006-2	10X Ligation Buffer	0.3ml
－	说明书	1份

保存条件：
    -20℃保存。
注意事项：
    对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方法转化大肠杆菌时，通常宜先用DNA纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化DNA，然后再进行电转。
    需进行平端连接或快速连接时，推荐使用碧云天的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase可以进行平端连接，但效率较低。
    普通连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在65℃孵育10分钟使T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA结合导致的条带位置迁移(band shift)。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明：
1. PCR产物或酶切片段和普通载体的连接：
   a. 取1-2μg载体酶切过夜，或至少酶切3-5小时以上。尽量确保酶切充分，否则后续会导致产生很多
      自连的克隆。
   b. 载体酶切完毕后，可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒
      (D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于50-
      60bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。
   c. 对于PCR产物：PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使
      用试剂盒进行操作，例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收
      DNA片段。
   d. 对于回收的PCR产物或其它需酶切的质粒或DNA片段，用适当内切酶酶切，随后纯化酶切产物。
      注：这一步的酶切不必酶切特别充分，通常酶切效率能达到80-90%以上即可。即本步骤的酶切
      通常酶切1-2小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯
      化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。
   e. 取约25-100ng经过酶切和纯化的载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体
      系。
      注1：很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少，在回收后很难定量。此时可根据回收前
      电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定
      量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计
      算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。
      注2：通常每个反应使用0.2-0.5μl连接酶已经足够，如果希望进一步提高连接效率，可以把连
      接酶的用量提高至1μl。

载体	约50-100ng
待插入片段	约载体摩尔数的3倍
10X Ligation Buffer	2μl
双蒸水或MilliQ水	至20μl
T4 DNA ligase	0.2-0.5μl
总体积	约20μl

   f. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
   g. 20-25℃孵育连接1-2小时，或16℃孵育连接过夜。
      注1：对于双平端连接必须连接过夜。对于双平端连接，直接使用T4 DNA Ligase连接效率较低，
      推荐使用碧云天的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)。
      注2：为快速获得预期克隆可以参考如下方法：对于20μl的粘端连接反应，在连接1-2小时
      可以取10μl直接转化大肠杆菌，其余10μl可以16℃孵育连接过夜。如果第二天顺利获得克
      隆，即可进入下一步实验；如果第二天转化的大肠杆菌未获得预期的克隆，则可以取连接过
      夜的剩余连接产物再次转化大肠杆菌。
   h. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
2. PCR产物和T载体的连接：
   a. PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使用试剂盒进行操
      作，例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA片段。
   b. 按照T载体的说明书取适量T载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。
      注1：很多时候由于载体量和PCR产物的量都比较少，在回收后很难定量。此时可根据回收前电泳
      条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您
      的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出
      最终得到的载体量和PCR产物的量的比例关系。
      注2：通常每个反应使用0.2-0.5μl连接酶已经足够，如果希望进一步提高连接效率，可以把连
      接酶的用量提高至1μl。

T载体	适量
待插入片段	约载体摩尔数的3倍
快速连接缓冲液(2X)	2μl
双蒸水或MilliQ水	至20μl
Rapid T4 DNA ligase	0.2-0.5μl
总体积	约20μl

   c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
   d. 20-25℃孵育连接1-2小时，或16℃孵育连接过夜。
      注：为快速获得预期克隆可以参考如下方法：对于20μl的粘端连接反应，在连接1-2小时后可以
      取10μl直接转化大肠杆菌，其余10μl可以16℃孵育连接过夜。如果第二天顺利获得克隆，即可
      进入下一步实验；如果第二天转化的大肠杆菌未获得预期的克隆，则可以取连接过夜的剩余连接
      产物再次转化大肠杆菌。
   e. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
3. Linker或RNAi片段和载体的连接：
   a. 载体的酶切和纯化同步骤1a和1b。
   b. Linker或RNAi片段的退火可以选择适当的DNA退火缓冲液，例如碧云天的Annealing Buffer for
      DNA Oligos(5X)(D0251)，进行退火反应。
   c. 长度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和载体进行连接反应。例如
      载体为0.03pmol，则插入片段可以为0.15至0.3pmol。长度小于8bp的linker，比例需调整为10:1
      以上。
   d. 除插入片段的用量外，随后按照步骤1e，1f，1g，和1h进行。
4. DNA自身环化的连接：
    参考步骤1e，待插入片段换成适量的水即可。其余步骤按照步骤1f，1g，和1h进行。
5. 其它类型的DNA片段连接参考上述方法进行。

常见问题：
1. 连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少。
   a. 可能感受态细菌转化效率太低，用质粒作为阳性对照同时检测感受态的转化效率。
   b. 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。
   c. 可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照。
   d. 用存放DNA的溶液进行转化，作为阴性对照，检测感受态细菌是否存在问题。

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