碧云天生产的T3 DNA Ligase，即T3 DNA连接酶，是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种来源于T3噬菌体、ATP依赖型的双链DNA连接酶。T3 DNA Ligase能够有效催化粘性末端和平末端双链DNA分子的连接以及双链DNA或DNA与RNA杂合双链的缺刻修复。缺刻修复时，完整链为DNA，缺刻链5’端和3’端’分别为DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-DNA或RNA-RNA都是可以被T3 DNA Ligase修复的，因此T3 DNA Ligase也可以用于生成DNA-RNA和RNA-DNA融合链接的核酸，以及用于基于DNA模板的RNA连接以形成较长的RNA片段。

T3 DNA Ligase能够催化双链DNA中临近的5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键，且对A/T突出末端的连接效率高于C/G末端。

与T4 DNA Ligase相同，在T3 DNA Ligase反应体系中加入PEG6000可以显著提高其对平末端双链DNA的连接效率；而在缺少PEG6000的连接体系中，T3 DNA Ligase对平末端双链DNA分子的连接效率较低。另外，T3 DNA Ligase对NaCl的耐受性是T4 DNA Ligase的2倍，其在1.0M NaCl或KCl的条件下仍可保持95%的活性。因此，在涉及到高离子浓度连接的实验中，T3 DNA Ligase是理想的选择[1,2]。

碧云天生产的T3 DNA Ligase用于进行双链DNA粘性和平末端连接的效果参考图1。

图1. 碧云天生产的T3 DNA Ligase (D7019)与N公司同类产品(Competitor)用于进行双链DNA粘性和平末端连接的效果图。图A为碧云天生产的或N公司(Competitor)的T3 DNA Ligase重组连接产物转化DH5α涂LB平板的实测效果图。利用碧云天生产的BeyoFusion™ DNA Polymerase (D7220)，使用一端带有HindIII酶切识别位点，另一端带有SmaⅠ酶切识别位点的引物对靶基因进行PCR扩增，随后使用碧云天HindⅢ (D6389)/SmaⅠ (D6633)对1kb的PCR产物进行双酶切，获得一端带有粘性末端，另一端带有平末端的双链线性DNA分子，作为T3 DNA Ligase催化连接反应的底物。在20µl反应体系(66mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 1mM ATP, 7.5% Polyethylene glycol (PEG6000), pH7.6 @25℃)中，加入50ng经PCR扩增及HindⅢ/SmaⅠ双酶切产生的两端分别带有粘性末端和平末端的双链DNA片段，和50ng经HindⅢ/SmaⅠ双酶切线性化的pUC18载体(待插入DNA片段与pUC18载体的摩尔比为3:1)，再加入10µl的2X Reaction Buffer以及1μl的本产品或N公司(Competitor)的T3 DNA Ligase，然后用水补至20µl，25℃孵育30分钟进行连接。反应结束后，取5µl连接产物转化DH5α超级感受态细胞(D1031)。图B为菌落PCR鉴定T3 DNA Ligase重组连接构建得到的克隆。实验结果表明，本产品与N公司的产品具有相当的连接粘性末端和平末端双链DNA的效果。菌落PCR鉴定使用的是pUC18载体的通用测序引物：M13 forward sequencing primer (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')和M13 reverse sequencing primer (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')。本图仅供参考，实际检测效果可能有所不同。

用途：限制性内切酶切DNA片段的克隆，PCR产物的克隆连接，双链DNA和接头的连接，线性双链DNA的环化，双链DNA的缺刻修复，定点突变，高盐体系的连接，双链DNA缺刻修复，DNA引导的DNA与RNA连接，DNA引导的RNA连接。

来源：纯化自携带编码T3噬菌体DNA ligase的E.coli重组菌株。

活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of 100ng HindIII fragments of λ DNA in a total reaction volume of 20μl in 1 minute at 25℃ in 1X T3 DNA Ligase Reaction Buffer.

纯度：不含除T3 DNA Ligase之外的其它种类的DNA连接酶，不含内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

酶储存液：10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol (pH7.4 @25℃)。

2X Reaction Buffer:132mM Tris-HCl, 20mM MgCl₂, 2mM DTT, 2mM ATP, 15% Polyethylene glycol (PEG6000) (pH7.6 @25℃)。

失活或抑制：在不含有PEG6000的反应体系中65℃孵育10分钟。

-20℃保存，两年有效。

ATP是T3 DNA Ligase发挥催化活性所必需的辅助因子，而不是像E.coli DNA Ligase以NAD作为辅助因子的。因此连接反应体系中一定要保持终浓度为1mM的ATP。本产品提供的2X Reaction Buffer中已经包含了ATP和连接粘末端所需的PEG6000。

T3 DNA Ligase的催化底物是双链DNA或完整链为DNA的缺刻双链，不能直接用于单链DNA或RNA的连接反应，但可以用于DNA模板引导的单链DNA之间、单链RNA之间或单链DNA与单链RNA之间的连接。

T3 DNA Ligase的反应体系中含有7.5% PEG6000。如果后续实验体系不兼容PEG6000，可考虑自行配制不含PEG6000的连接反应缓冲液，或者使用T4 DNA Ligase (D7006)的连接缓冲体系，同时注意添加终浓度为1mM的ATP，但T3 DNA Ligase连接酶在T4 DNA Ligase (D7006)的连接缓冲体系中的活性会降低约10倍。

在不含PEG的反应体系中，T3 DNA Ligase可进行热失活。如果反应体系中含有PEG6000，T3 DNA Ligase不能进行热失活，否则会显著降低后续的转化效率。

如果连接体系中需要维持高浓度NaCl，建议使用不含PEG6000的缓冲液。

在标准的载体与片段连接的20μl反应体系中，通常需要在25℃下反应30分钟。

反应体系所需的超纯水推荐使用BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。