BeyoRTTM cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)

产品简介

产品简介：

产品编号	产品名称	产品包装	产品价格
D7166	BeyoRT™ cDNA第一链合成试剂盒(RNa se H-)	10次	368.00元

    BeyoRT™ cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)，即BeyoRT™ First Strand cDNA Synthesis Kit(RNase H minus)是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)，用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。
    采用本试剂盒可以合成长达13kb的cDNA第一链。在采用BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)的
情况下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。
    试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反
转录效果。
    试剂盒还提供了Oligo(dT)₁₈和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的
反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
    试剂盒中提供的Control Primer为17聚，即引物的长度为17个碱基。试剂盒中提供的Control RNA为带有3’poly(A)的1.1kb RNA。
    使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成
等。
    本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时足够进行10个cDNA第一链样品的合成。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D7166-1	BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)(200U/μl)	2000U
D7166-2	Reaction Buffer(5X)	50μl
D7166-3	RNase Inhibitor(20U/μl)	10μl
D7166-4	dNTP Mix(10 mM each)	20μl
D7166-5	Oligo(dT)₁₈ Primer(0.5μg/μl)	10μl
D7166-6	Random Hexamer Primer(0.2μgμl)	10μl
D7166-7	Control RNA(20ng/>μl)	6μl
D7166-8	Control Primer(5pmol/μl)	6μl
D7166-9	DEPC-treated Water	0.2ml
－	说明书	1份

保存条件：
    -20℃保存。
注意事项：
    对于GC含量比较高的RNA的反转录，试剂盒的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
    本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放
于普通住宅内。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明：
1. cDNA第一条链的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a. 参考如下表格设置反转录反应：

模板(后面4种任选一种)	Total RNA	0.01-5μg
	或Poly(A) RNA/mRNA	1-500ng
	或Specific RNA	0.01pg-500ng
	或Control RNA	2μl
引物(后面3种任选一种)	Oligo(dT)₁₈ Primer (0.5μg/μl)	1μl
	Random Hexamer Primer (0.2μg/μl)	1μl
	Gene specific primer	15-25pmol
DEPC-treated Water	－	To 12μl*
70℃孵育5分钟，随后立即放置到冰浴冷却，4℃微离心，随后加入下述试剂**
Reaction Buffer (5X)	－	4μl
RNase Inhibitor (20U/μl)	－	1μl
dNTP Mix (10 mM each)	－	2μl
BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)	－	1μl
总体积		20μl

      * To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。
      ** 70℃孵育5分钟并且随后冰浴冷却，这样可以使RNA模板的二级结构充分打开。
   b. 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。
   c. 如果使用Oligo(dT)₁₈作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用random
      hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。注意：对于
      GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。
   d. 70℃孵育10分钟以失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。说明：对于长
      片断的cDNA不推荐采用加热的方法失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)，这种操作可能
      会导致部分长片断DNA被剪切。
   e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应
      时，如果PCR的反应体系为50微升，则推荐使用2微升反转录产物。
2. 其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。

常见问题：
1. RNA反转录产物电泳观察不到。
   反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，
   因此通常RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
   PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成
   功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然
   也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录
   产物质量欠佳。

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