|
||||||||||
产品简介
产品简介：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
D7167 |
20次 |
165.00元 |
碧云天生产的BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)，即BeyoRT™II First Strand cDNA
Synthesis Kit (RNase H minus)，是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase
H-)，用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。
使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantita
tive PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。
使用本试剂盒可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录(参考图1)，反转录的最大长度可以超过
10 kb。在采用BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)的情况下，由于缺失了RNase H酶活性，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。
图1. 使用本试剂盒对总RNA反转录后，对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中
可见对于0.2-8kb的cDNA可以非常高效地被反转录。
本试剂盒中的BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)热稳定性高，最适反应温度为42-45℃，但当温度达到50℃时仍具有很高活性，且可获得较高产量的cDNA。
试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反
转录效果。
试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的
反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时足够进行20个cDNA第一链样品的合成。
包装清单：
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
D7167-1 |
BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) |
20μl |
D7167-2 |
Reaction Buffer (5X) |
0.1ml |
D7167-3 |
RNase Inhibitor (20U/μl) |
20μl |
D7167-4 |
dNTP Mix (10 mM each) |
40μl |
D7167-5 |
Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl) |
20μl |
D7167-6 |
Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) |
20μl |
D7167-7 |
DEPC-treated Water |
0.3ml |
— |
说明书 |
1份 |
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中都给予了特别说明，请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放
于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明
使用说明：
1. cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 参考如下表格设置反转录反应(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可从碧云天订购)：
模板（右侧3种任选其中一种） |
Total RNA |
0.1 ng-5 μg |
或poly(A) RNA/mRNA |
10 pg-0.5 μg |
|
或specific RNA |
0.01 pg-0.5 μg |
|
引物（右侧3种任选其中一种） |
Oligo(dT)18 primer |
1 μl |
或 Random Hexamer primer |
1 μl |
|
或 gene-specific primer |
15-25 pmol |
|
DEPC-treated Water |
－ |
To 12 μl* |
选择性步骤：如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级 |
||
Reaction Buffer (5X) |
－ |
4 μl |
RNase Inhibitor (20U/μl) |
－ |
1 μl |
dNTP Mix (10mM each) |
－ |
2 μl |
BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) |
－ |
1 μl |
总体积 |
|
20μl |
*To 12μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为12μl。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物，42℃孵育60 min。如果使用random hexamer(随机六聚
体)作为引物，先在25℃孵育10 min，随后在42℃孵育60 min。注意：对于GC含量较高或二级结
构比较严重的模板RNA，可以50℃孵育60 min，以充分利用本产品中的反转录酶在50℃时仍有良
好活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
d. 80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。说明：对于
5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪
切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应
时，如果PCR的反应体系为20和50微升，则推荐相应地使用0.8和2微升反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。
常见问题：
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板
量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不
到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以
成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠
佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在
问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S
和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则
提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格
进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽
量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、
EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，
或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用碧云天的BeyoZol
或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行
DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至
终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量
不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目
的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由
于模板量过少而PCR扩增失败。
e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物
代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。
f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-50℃。
相关产品：
产品图片
相关产品
相关论文
 苏ICP备06009238号 |