使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、检测缓冲液、显色液和底物，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.10mM NADH标准溶液的配制：在本试剂盒提供的5mg NADH中加入655μl检测缓冲液，充分溶解并混匀，即为10mM的NADH标准溶液。除待用部分外，其余NADH标准溶液适当分装后-80ºC避光保存。
c.显色工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应80μl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合74μl检测缓冲液(Fumarate Assay Buffer)、2μl酶溶液(Enzyme Solution)、2μl显色液(Chromogen Solution)、2μl底物(Substrate)，即可配制成80μl显色工作液(Working Solution)。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。注：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。

Samples	1	10	20	50
Fumarate Assay Buffer (μl)	74	740	1480	3700
Enzyme Solution (μl)	2	20	40	100
Chromogen Solution (μl)	2	20	40	100
Substrate (μl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

注：当样品有背景会对检测产生干扰需时，需同时设置样品背景对照孔，加入不含底物的显色工作液，即配制显色工作液时2µl底物用检测缓冲液替代。计算时样品孔的读数值需要减去样品背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.NADH标准曲线的设置：取10μl NADH标准溶液(10mM)，加入90μl检测缓冲液，混匀，配制成浓度为1mM的NADH标准溶液。分别取1mM的NADH标准溶液0、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用检测缓冲液补足到20μl，此时标准曲线的浓度为0、100、200、400、600、800、1000μM。
b.阳性对照的设置：用检测缓冲液将阳性对照(100X)做100倍的稀释，然后取20μl加入96孔板作为阳性样品。例如取阳性对照1μl，加入检测缓冲液99μl，混匀后取20μl加入96孔板作为阳性样品。
c.取1-20μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入检测缓冲液至样品孔中，补足到20µl。同时设置仅含检测缓冲液的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的量。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
d.各孔加入显色工作液80μl，混匀。
e.立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A450，此时记录为0分钟读值A1。
f.37ºC反应10-30分钟，反应时间记为T，测定A450，记为A2。信号的增强取决于延胡索酸酶催化产生的NADH的量，ΔA = A2 – A1。
注：为取得最佳的检测效果，反应时间可以根据待测样品中的延胡索酸酶活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于延胡索酸酶活性较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟；对于延胡索酸酶活性较低的样品，可以延长测定总时间为1至2小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟。也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取呈线性的时间点前的数据用于分析和计算。
g.建立NADH标准曲线，将ΔA代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中延胡索酸酶催化产生的NADH浓度(记录为B)。NADH标准曲线可以参考图2，在20-1000μM浓度范围内有良好的线性关系。样品延胡索酸酶的活性(Fumarase Activity)计算公式如下：
Fumarase Activity (U/L) = B × n / T
注：B为步骤3g根据标准曲线确定的NADH浓度(µM)；
n为步骤3c样品总稀释倍数；
T为步骤3f的反应时间(min)。
延胡索酸酶活力单位的定义：1个酶活力单位(unit, U)在37ºC条件下，在1分钟内可以催化生成1µmol NADH。
参考文献：
1.Yogev O, Naamati A, Pines O. FEBS J. 2011. 278(22): 4230-4242.
2.Estévez M, Skarda J, Spencer J, Banaszak L, Weaver TM. Protein Sci. 2002. 11(6):1552-1557.
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